Fransen vereenvoudigen lasermicroscopie

Onderzoekers denken een techniek te hebben ontwikkeld die lasermicroscopen fijnere details kan laten tonen. De techniek zou ook kunnen worden gebruikt om 3d-nanostructuren te produceren en zelfs de datadichtheid in blu-rays te vergroten.

De techniek die de onderzoekers van het Franse Fresnel Instituut onder leiding van Anne Sentenac ontwikkelden, is gebaseerd op een 3d-lasermicroscopische techniek die 4Pi wordt genoemd. Daarmee wordt een laserbundel in twee bundels gesplitst. De ene bundel schijnt van bovenaf op het te bestuderen object, terwijl de tweede bundel van onderaf schijnt. Beide bundels interfereren met elkaar en maken op die manier het brandpunt ondieper, waardoor kleinere details kunnen worden onderscheiden.

Het afstellen en uitlijnen van beide bundels van een 4Pi-lasermicroscoop met behulp van lenzen maakt de microscopen echter duur, reden voor Sentenac en haar collega's om een alternatief te zoeken. Zij splitsten de laserbundel niet langer, maar plaatsten simpelweg een spiegel onder het sample. De interferentie tussen de originele en de gereflecteerde laserbundel is vergelijkbaar met die van 4Pi-microscopie, aldus de onderzoekers.

Een vloeibaarkristalmodulator werd gebruikt om de laserbundel zodanig te manipuleren dat twee brandpunten ontstonden. De ene werd direct op het sample gericht, terwijl het tweede brandpunt via de spiegel op het sample was gericht. Op die manier werd een brandpunt van 200nm groot gerealiseerd. De techniek zou niet alleen tot goedkopere microscopen voor onder meer biologen kunnen leiden, maar zou ook kunnen worden gebruikt om nanostructuren te etsen. Ook zouden blu-ray-schijven meer lagen kunnen krijgen, omdat het brandpunt van de laser minder diep is.

Helaas!
De video die je probeert te bekijken is niet langer beschikbaar op Tweakers.net.

Reacties (22)

[innerchild]

hoe oneindig kan je doorgaan in de diepte en daar ook daadwerkelijk wat mee kan doen..
afhankelijk van de beschikbare middelen die je hebt of door de wetten van de natuur ?

[LightPhoenix]

Wetten van de natuur staan je op een gegeven moment in de weg. Wanneer je gebruik maakt van lichtmicroscopie is het o.a. de golflengte van het licht wat een limiterende factor is. Verder is de Numerieke Apertuur ook van belang. Deze zijn mooi samen genomen in Abbe's Law.

De 4Pi microscoop gebruikt een truc om dmv interfererende laserpatronen deze wet te omzeilen en zo zijn er nog meer opkomende manieren. Denk aan STED, SIM, STORM/PALM en dan zijn er nog wel een paar. Gaat een beetje ver om alles toe te lichten, maar een mooi overzicht van nieuwe technieken vind je op de Wiki pagina over microscopie. Veel van deze ideeën zijn niet heel nieuw, maar we hebben vaak nu pas de techniek om ze uit te kunnen werken.

Nadeel van veel nieuwe technieken is dat ze vooral voor gefixeerde preparaten goed werken. Levende preparaten zijn vaak te bewegelijk en zo snel zijn de technieken helaas nog niet (STED-CW komt wel dichtbij overigens).
En het Optical Image Center van het Erasmus MC heeft overigens een 4Pi staan... mooi ding!

edit: Crap, moet een reactie op innerchild zijn. Excuus voor de mess up.
edit2: Ah check, gefixed

[Reactie gewijzigd door LightPhoenix op 23 juli 2024 03:58]

[Mont2uk]

Interessant stukje! Een vloeistofkristal modulator is overigens een stukje techniek dat gebruikt wordt om echt razendsnel een lichtbundel of iets dergelijks "de pas af te snijden". Zoiets als het sluitermechanisme in een fotocamera eigenlijk, maar dan anders. Ik zal de natuurkundige onderbouwing niet opschrijven, maar hier kan je wat meer info vinden indien je er interesse in hebt!

Duidelijk verteld voor de leek LightPhoenix!

Met bacteriën valt het last heben van beweging in het algemeen mee overigens, althans dat is te ondervangen. Ik heb mee geholpen aan onderzoek met live cell imaging mbv CLEM microscopie. Een protocol geschreven om juist bewegingen tijdens live cell imaging te "tracken". Zo kan je dus een individuele bacterie of zelf een deel daarvan volgen. Door toepassing van CLEM zorg je er ook voor dat fototoxiciteit zoveel mogelijk tot een minimum wordt beperkt.

Het tijdsbestek waar ik het over heb bedraagd enkele uren tot zelfs een aantal dagen.

[Anoniem: 175233]

4PI omzeilt Abbe's Law helemaal niet... Wat Abbe in weze omschrijft is dat de spotgrootte bepaald wordt door de ruimtehoek van je lichtbundel. (hetgeen je uitdrukt in NA) Door een extra objectief te gebruiken, wordt de gebruikte ruimtehoek groter (in de Z richting), en dus je spot kleiner (logischerwijze ook voornamelijk in Z) .

4PI is inderdaad heel irritant in de praktijk... Van iedereen die er één heeft, hoor ik altijd dat het vrijwel niet gebruikt wordt, omdat het te lastig in het gebruik is. En da's best klote met een microscoop die een miljoen euro kost... (Hoop dat Stefan Hell geen Nederlands sprekende medewerkers heeft, anders komt die nu even van toren 2 naar toren 3 om een woordje met me te spreken. ;-) 4PI in hier in Göttingen ontwikkeld. )

STED en STORM e.d. zijn wezenlijk anders, en omzeilen Abbe's limiet wel, omdat je daar een niet-lineariteit van je fluoroscente molecuul gebruikt. Dat is qua microscopie veel makkelijker, maar dan kom je weer in problemen met de biochemie. Maar dat lijkt eenvoudiger op te lossen.

Heb het idee dat 4PI op dit moment een beetje op de achtergrond blijft, vanwege de praktische bezwaren. Zou kunnen dat deze ontwikkeling 4PI een nieuwe impuls geeft.

[Dutchtraveller]

Goed bedacht.
Dit is veel makkelijker dan 2 laserbundels stabiel te laten interfereren.
Slechts een spiegeltje en een LCD als spatiele modulator.

Zo kun je een object in 3D scannen op hoge resolutie.
200nm is ongeveer de helft van de golflengte van violet licht maar de verbetering zit vooral in de axiale (z-richting) resolutie denk ik.

[dragonfly28]

de laterale resolutie is ook te verbeteren, maar voor zover ik het goed heb begrepen richt 4Pi zich er inderdaad om de axiale resolutie te verbeteren.

In een 'gewone' (widefield) microscoop is de axiale resolutie eigenlijk oneindig groot; in een confocale microscope wordt dat door het gebruikt van een pinhole terug gebracht tot ongeveer 1 mu. (de laterale resolutie wordt als een bonus wortel 2 beter).
Door van de onderkant van het sample te komen onderdruk het onderste gedeelte van het axiale volume.

Kan me ook nog voorstellen dat omdat je fluorescentie microscopie doet dat je een optimaal klein volume kan maken door je excitatie energie te tweaken. En er zodoende voor te zorgen dat je alleen in het gedeelte waar zowel het heengaande als het teruggaande excitatie licht door heengaat de excitatie effeicientie hoog genoeg is om een fatsoenlijk fluorescentie signaal te generen

[Anoniem: 175233]

Hoe komt je er bij dat in widefield de axiale resolutie oneindig is? Die is gewoon hetzelfde als in confocaal. (Bepaald door de NA van je objectief).

Probleem is dat in dikke samples, je ook strooilicht van boven en onder je focus vlak krijgt. Maar dat is wel uit-focus, en dus homogeen. Dat is irritant, en verlaagt het contrast, maar tast niet de focus aan.

Sterker, als je met wide-field meerdere secties maakt, en dan door een convolutie software haalt (Huygens van SVI bijvoorbeeld) dan kom je heel dicht bij het beeld van een confocale microscoop.

Wat je beschrijft qua excitatie energie tweaken, is alleen mogelijk via 2-foton excitatie. Daarbij krijg je alleen in het focus genoeg energie dichtheid om het 2-foton effect efficient te produceren. (2 fotons op hetzelfde tijdstip en plaatst die tezamen een energie overgang induceren die gelijk staat met 1 foton van halve golflengte) En dan zorgt het focus opzichzelf voor de 'tweak'...
Met normale fluorescentie zul je altijd en overal in je licht pad excitatie produceren. Immers, er is slechts 1 foton nodig om 1 molecuul te exciteren...en dan maakt de energie dichtheid dus niet uit voor waar het gebeurt. De totale hoeveelheid fluorescentie is uiteraard evenredig met de hoeveelheid excitatie licht. (totdat je in verzadiging komt, maar dat is juist een zeer ongewenst tweak...)

[dragonfly28]

Je hebt een punt wat betreft de axiale resolutie maar dat is niet helemaal hoe ik het bedoelde. Ik ging uit van een enkele slice. Dan blijft het een feit dat je met een widefield microscoop geen onderscheid kan maken tussen een wazig object in focus of een scherp object uit focus.

Als je een stack van widefield plaatjes maakt en daar dan een deconvolutie doet (zoals bv met Huygens) dan los je dat probleem op.

Voor 1 photon excitatie ook te maken met een absorptie waarschijnlijkheid en die is 2 keer zo groot als je de weglengte verdubbeld. Het hangt natuurlijk wel af van de concentratie van fluorofoor af. Als die te hoog is of als de fluorofoor te snel diffundeert heeft het geen zin.

Verzadiging hoeft niet perse slecht te zijn. Als ik me niet vergis moet je voor STED ook eerst een staat van verzadiging bereiken voordat je je stimulated emission puls geeft. (?)

[Zunflappie]

Duidelijk filmpje wat goed uitlegt hoe zoiets werkt.
Maar die rechtse kleine 'punt', dan dan toch door nog een lens, om het nogmaals te verkleinen?

[LightPhoenix]

Hmm... ik weet niet helemaal of ik antwoord geef op wat je bedoeld, zo niet dan hiervoor excuus.

De punt rechts van de lens (en links van de spiegel) is een plek in het object waar je op scherp stelt. In de moderne lichtmicroscopie word gebruikgemaakt van fluorescente stoffen. Je schijnt hier op met een bepaalde kleur (golflengte) laser om de fluorescente moleculen op die plek 'aan te slaan' en er komt een andere kleur (golflengte) terug.

Het bolletje wat je dus ziet is de enige plek waar moleculen worden belicht. Er komt van dit bolletje licht terug en er word onthouden op welke plek dit zo gebeurd. Hierna word het punt van de belichting verschoven en gebeurd hetzelfde. Uit het terug opgevangen licht word een beeld samengesteld.

De hoeveelheid licht die terug komt is heel erg klein en elke lens die je er tussen zet (of ander optisch element) zorgt er voor dat er licht (en dus ook informatie) verloren gaat. Je kunt dus beter een veel betere lens maken dan heel veel slechtere lenzen achter elkaar.

Of heb ik je nou echt helemaal verkeerd begrepen?

[bredend]

Inderdaad, erg fijn als wetenschappers duidelijk uitleggen wat ze doen/ontdekt hebben!

[Tha_T]

Dat werd tijd want mijn lasermicroscoop is echt een hel om mee te werken. User manuals? Ben je gek.

[hiddepolen]

Dat is een heel mooi idee. Ik zou er wel eens een in het echt willen zien!

[Anoniem: 6977]

Ow sorry. Ik zit hier verkeerd.
Ik dacht dat het ging over laseren van ogen.

Met vriendelijke groet,

Opticien Henk

[Dark Angel 58]

lol... en ik dacht aan een nieuwe soort lasermicroscoop voor medische wereld tot ik Blu-Ray las...

[Felyrion]

toch wel:

De techniek zou niet alleen tot goedkopere microscopen voor onder meer biologen kunnen leiden.....

beide dus

[careltjuh]

dat is zeker goed doorgedacht en goed simpel uitgelegd en de data dicht van een blu ray nog groter maken dat klingt ook goed

[Triblade_8472]

Hmmm, 'zien'...?

Maaruh, Ik ben wel benieuwd of dit wel weer een techniek is dit wat een 'revolutie' is. Al die technieken die een paar gigjes toevoegen... Ik wil een echte doorbraak!

[Anoniem: 201824]

Het is toepasbaar op o.a. blueray, en kan vast wel even wat meer dan 'een paar gigjes' zou kunnen toevoegen (1 laag is 25gb lees ik op wikipedia, het artikel spreekt van 'meer lagen kunnen toevoegen'). Dus reken maar uit.

[Japperrrr]

Terwijl wij het hier hebben over deze nieuwe ontwikkeling zijn anderen alweer bezig met de volgende. Pff, wat gaat dat toch snel met opslagmedia. Wie had er 10 jaar geleden gedacht ooit zoveel data op een enkel schijfje te kunnen bewaren.

[RetepV]

Eh, Gene Roddenberry?

[Cappellen]

Ter aanvulling de 4Pi microscoop in het Erasmus MC wordt regelmatig gebruikt voor
ons biologisch onderzoek naar kleine structuren in cellen. De axiale resolutie is ongeveer 140nm en lijkt hiermee wat beter te zijn, dan het franse ontwerp. Het zou heel mooi zijn wanneer de franse vinding een tweede leven voor het 4Pi principe zou kunnen inluiden. Het 4Pi principe is nog steeds veruit de beste manier voor verbetering van de axiale resolutie. Wanneer dit makkelijker toepasbaar wordt, dan wordt het voor meer onderzoekers en voor meer doelen bruikbaar.